RT-QPCR EasyTM Taqman una mezcla principal en tiempo real del paso RT-PCR

RT-qPCR EasyTM (un paso) - Taqman

Para la polimerización en cadena en tiempo real usando cDNA, purificó la DNA

Introducción de productos

Los productos fáciles de un solo paso de la serie de Foregene RT-PCR realizan que la reacción integrada del ARN a la DNA doble-trenzada, es decir, invertir la transcripción y la amplificación de la polimerización en cadena están terminadas en el mismo tubo de centrífuga de la reacción y el mismo sistema de reacción, así los pasos experimentales simplificados, el plan experimental optimizaron, y la eficacia experimental mejoró.

RT-qPCR EasyTM (un paso) - Taqman usando la polimerasa de DNA de Foregene HotStar Taq, el sistema optimizado del qPCR de Taqman puede realizar rápidamente y específicamente la detección cuantitativa en tiempo real RT-qPCR de plantillas del ARN del rastro.

Condiciones del transporte y de almacenamiento

• Condiciones del transporte: El proceso entero se transporta en una caja de hielo a baja temperatura para asegurarse de que el equipo está en un estado de <4>
• Condiciones de almacenamiento: El equipo se almacena en -20℃. Almacene el producto en un refrigerador de la temperatura constante en -20℃ inmediatamente después del recibo. Si las condiciones de almacenamiento son apropiadas, el producto no degradará ningún funcionamiento durante el período de un año de la validez.

Información componente del equipo

• Mezcla-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM: Revés Transcriptase, inhibidor de la ARNasa, polimerasa de DNA de Foregene HotStar Taq, ratio optimizado de Foregene de los dNTPs, Mg2+, estabilizador, reforzador, y optimizador.
• Tinte de la referencia de ROX: Utilizado generalmente en cyclers termales en tiempo real de la polimerización en cadena de compañías tales como ABI, Stratagene, etc., para ajustar la diferencia entre los tubos de la polimerización en cadena causados por errores de cargamento de la muestra de la polimerización en cadena. La concentración de tinte de la referencia de ROX requerido por diversos instrumentos es diferente, y el usuario puede añadirla según la concentración recomendada del instrumento.

Precauciones:

los reactivo de u deben evitar la congelación repetida y el deshielo, si no el funcionamiento de los reactivo disminuirá o llegará a ser inválido.

u los reactivo en el equipo se debe proteger contra luz y almacenar en -20°C.

u se recomienda para utilizar la extracción de la muestra o el ARN fresca de la plantilla almacenado en -80°C (el ARN debe evitar la congelación repetida y el deshielo).

u para evitar la contaminación de la ARNasa, realiza por favor el experimento en el espacio ARNasa-libre; las extremidades de la pipeta y los tubos de la polimerización en cadena usados deben ser ARNasa-libres; y lleve los guantes disponibles y las máscaras.

u este equipo se debe utilizar con las cartillas específicas para los experimentos. Seleccione por favor las cartillas específicas para que el gen sea amplificado según las necesidades del experimento.

u antes de usar, puso la mezcla-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM en el hielo totalmente al derretimiento, a la película y a la mezcla mucho antes uso; la preparación del sistema se debe actuar en un baño de hielo para mejorar el funcionamiento del equipo y para aumentar la amplificación de la polimerización en cadena.

Concentración del ARN de la plantilla

RT-qPCR EasyTM (un paso) - Taqman: (1 ARN del total del ng pg-100 sistema)/20 μl.

Guía de la operación

: Preparación de materiales y de reactivo

• Prepare la plantilla preparada del ARN (se recomienda para utilizar equipos de la serie del equipo del aislamiento del ARN del total de Foregene para extraer y para purificar el ARN), las cartillas específicas (μM 10) y los materiales consumibles y los instrumentos relacionados.

Nota: Asegure por favor la integridad del ARN e intente utilizar el ARN extraído de muestras frescas.

• Mezcla-Taqman puesta de 2× RT-qPCR EasyTM, tinte ARNasa-libre de la referencia de ddH2O, y de 20× ROX (en caso de necesidad) en el hielo para dejarlo derretir naturalmente, y chasquear la pared del tubo para mezclarse hasta uso.

B: Preparación del sistema RT-qPCR

La mezcla-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM es conveniente y rápida de utilizar, y evita la contaminación durante la operación y los errores experimentales causados por las preparaciones múltiples del sistema de reacción en la mayor medida posible. Al usar, solamente la mitad del volumen del sistema de reacción (por ejemplo, si el sistema de reacción es el μl 20, tome 10 la solución de la mezcla-Taqman del μl 2× RT-qPCR EasyTM), añade la cantidad apropiada de plantilla del ARN y de cartillas específicas, y añade ddH2O ARNasa-libre para componer el volumen. La preparación específica del sistema de reacción RT-qPCR puede referirse para presentar 1 abajo.

Cuadro 1: Preparación del sistema RT-qPCR

Nota: La cartilla delantera y la cartilla reversa son cartillas específicas para el gen de la blanco. El sistema del qPCR se puede ajustar según necesidades experimentales y modelo de la polimerización en cadena. Para la concentración final de la mayoría de las cartillas, recomendamos 400nM. Ajuste por favor la dosificación de la cartilla y de la punta de prueba específicas según la concentración preparada según nuestra concentración final recomendada. Para el qPCR con el sistema 50μl, refiera por favor al sistema 20μl para ajustar la cantidad de reactivo proporcional.

1*: Elija la concentración final apropiada de tinte de la referencia de ROX según diversos instrumentos cuantitativos de la polimerización en cadena. La concentración óptima de tinte de la referencia de ROX para las máquinas cuantitativas comunes de la polimerización en cadena se muestra en la tabla siguiente:

C: Ajuste del sistema de reacción RT-qPCR

• Después de preparar el sistema RT-qPCR referente a la tabla antedicha, mezcla suavemente (usted puede utilizar una extremidad de la pipeta suavemente a la pipeta; usted puede también mezclarse en un vortexer y una centrifugadora brevemente para recoger el líquido dispersado en la pared del tubo o el casquillo del tubo, y un lugar en la caja de hielo para su uso posterior).
• Refiera a los ajustes del programa de la reacción RT-qPCR (cuadro 2) para fijar la temperatura y el tiempo de la reacción.

Nota: Para asegurar la actividad de la mezcla-Taqman de 2× RT-qPCR EasyTM y mejorar su eficacia de la amplificación, es el mejor preparar el sistema de reacción RT-qPCR después de poner el programa del instrumento de la polimerización en cadena, para poder incorporar el programa de la reacción inmediatamente después que se termina la preparación del sistema.

• Para conseguir el mejor efecto del qPCR, la polimerización en cadena de la pendiente se puede utilizar para optimizar las condiciones de la reacción para diversas plantillas y diversas cartillas.

Nota: La extensión que la gama de temperaturas de la polimerasa de DNA de Foregene Hotstar Taq proporcionó en este equipo es: 60-72℃, y la mejor temperatura de la extensión es 72℃.

Lo que sigue es un ejemplo de las condiciones de la reacción RT-qPCR. Se recomienda para utilizar un método de dos etapas para la reacción de la polimerización en cadena. Cuando la concentración de la plantilla es demasiado baja causar la amplificación no específica, el valor bajo de TM de la cartilla lleva a la eficacia baja de la amplificación o repetibilidad pobre de la curva de la amplificación, etc., se recomienda para intentar el método del tres-paso para la reacción de la polimerización en cadena. Refiera al cuadro 2-1 (método de dos etapas) y al cuadro 2-2 (método del tres-paso) para el ajuste de las condiciones de la reacción RT-qPCR.

Cuadro 2-1: Determinación del programa de la reacción RT-qPCR (método de dos etapas)

Cuadro 2-2: Determinación del programa de la reacción RT-qPCR (método del tres-paso)

1*: El tiempo reverso de la transcripción se puede ajustar según necesidades experimentales. Los genes endógenos generales tales como β-actinia necesitan solamente 10 minutos; para detectar genes expresados específicos, el tiempo reverso de la transcripción se puede prolongar apropiadamente según las necesidades.

2*: Fije un momento específico según la longitud del fragmento amplificado de la blanco. La velocidad de la amplificación de la polimerasa de DNA de Foregene HotStar Taq es 2kb/min

Nota: Las condiciones de la reacción de la polimerización en cadena varían dependiendo de las condiciones estructurales de la plantilla, de las cartillas, del etc. Para las plantillas del ARN con las estructuras secundarias complejas, se recomienda para utilizar 42℃ para el primer paso de la transcripción reversa. En la operación específica, es necesario diseñar las condiciones óptimas de la reacción según las condiciones específicas tales como el tamaño del fragmento de la blanco, la secuencia baja del fragmento amplificado y el contenido de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA y la longitud de la cartilla, incluyendo temperatura, tiempo de la extensión, el etc. de recocido.

Flujo de trabajo: