Preparación y precauciones de la extracción del ARN

Esterilización de las extremidades de la pipeta y tubos del EP, etc.

1. Prepare 0,1% (un milésimo) DEPC (sustancia altamente tóxica) con agua desionizada, utilícelo cuidadosamente en una capilla del humo, y almacénelo en 4°C lejos de la luz;

El agua de DEPC es agua pura tratada con DEPC y esterilizada por la temperatura alta y la alta presión. Probado para estar libre de la ARNasa, de la ADNasa y de la proteinasa.

2. Ponga la extremidad de la pipeta y el tubo del EP en 0,1% DEPC, y asegúrese de que la extremidad de la pipeta y el tubo del EP están llenados de 0,1% DEP.

3. Proteja contra ligero, deje el soporte, durante la noche (12-24h)

4. La caja que contiene la extremidad y el tubo del EP no necesita ser empapada en DEPC. Después áspero de quitar el agua de DEPC en la extremidad o el tubo del EP, embálelo para arriba y envuélvalo para arriba.

5. 121 grados de Celsius, 30min

6. 180 grados de Celsius, se secan por varias horas (por lo menos 3 horas)

Nota: ¡a. guantes y máscaras del látex del desgaste al dirigir DEPC! b, o sin la esterilización de DEPC, 130 ℃, autoclave 90min (esterilización da alta temperatura de muchos laboratorios dos veces)

Consideraciones de la extracción del ARN

Dos fenómenos importantes del fracaso del aislamiento del ARN del tejido

La degradación del ARN y los residuos de impurezas en tejidos, con respecto a la degradación, nos dejaron primero mirar porqué el ARN extrajo de las células cultivadas no se degrada fácilmente. Los reactivo existentes todos de la extracción del ARN contienen los componentes que inhiben rápidamente la ARNasa. Añada el lysate a las células cultivadas, y mézclelo simplemente, todas las células se pueden mezclar a fondo con el lysate, y las células lysed totalmente. Después de que las células lysed, los ingredientes activos en el lysate inhiben inmediatamente la ARNasa intracelular, así que el ARN permanece intacto. Es decir, porque las células cultivadas se entran en contacto con fácilmente y completamente con el lysate, su ARN no se degrada fácilmente; por otra parte, el ARN en el tejido se degrada fácilmente porque las células en el tejido no son fáciles entrar en contacto con rápidamente el lysate. debido al suficiente contacto. Así pues, el asumir allí es una manera de dar vuelta al tejido en una célula mientras que la actividad de inhibición del ARN, el problema de la degradación podría ser solucionada totalmente.

El moler del nitrógeno líquido es el más eficaz tal método. Sin embargo, el método que muele del nitrógeno líquido es muy molesto, especialmente cuando el número de muestras es grande. Esto dio lugar a la mejor cosa siguiente: el homogeneizador. El método del homogeneizador no considera la cuestión de cómo la actividad de la ARNasa se inhibe antes de que las células se entren en contacto con con el lysate, pero ruega bastante que el índice de interrupción del tejido es más rápido que la tarifa en la cual la ARNasa intracelular degrada el RN.

El efecto del homogeneizador eléctrico es mejor, y el efecto del homogeneizador de cristal es pobre, pero en general, el método del homogeneizador no puede prevenir el fenómeno de la degradación. Por lo tanto, si se degrada la extracción, el homogeneizador eléctrico original se debe utilizar para moler con nitrógeno líquido; el homogeneizador de cristal original se debe cambiar a un homogeneizador eléctrico o moler directamente con nitrógeno líquido. El problema es el casi 100% posible. consiga resuelto.

El problema del residuo de la impureza que afecta a experimentos subsiguientes tiene causas más diversas que la degradación, y las soluciones son correspondientemente diferentes. En conclusión, si hay degradación o impurezas residuales en el tejido, el método/el reactivo de la extracción para el material experimental específico debe ser optimizado. Usted no tiene que utilizar sus muestras preciosas para la optimización: usted puede comprar algunos pequeños animales como pescados/pollo del mercado, tomar la parte correspondiente del material para la extracción del ARN, y la otra pieza para la extracción de la proteína - rutina con la boca, el estómago y el extracto de los intestinos.

El ARN de la blanco del ARN extraído se utiliza para diferente sigue experimentos, y sus requisitos de calidad son diferentes

la construcción de la biblioteca del cDNA requiere integridad del ARN sin residuos de inhibidores de la reacción enzimática; Septentrional requiere una integridad más alta del ARN y baja los requisitos para los residuos de los inhibidores de la reacción enzimática; RT-PCR no requiere integridad demasiado alta del ARN, sino inhibe reacciones enzimáticas. Los requisitos del residuo son estrictos. La entrada determina la salida; cada vez que la meta es obtener el ARN de la pureza más elevada, costará la gente y el dinero.

Colección/almacenamiento de muestras

Los factores que afectan a la degradación después de que la muestra salga el body/or vivo del ambiente original del crecimiento, las enzimas endógenas en la muestra comenzarán a degradar el ARN, y la tarifa de la degradación se relaciona con el contenido de enzimas endógenas y de la temperatura. Tradicionalmente, hay solamente dos maneras de inhibir totalmente actividad enzimática endógena: añada el lysate inmediatamente y homogenéicelo a fondo y rápidamente; corte en pequeños pedazos y congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. Ambos acercamientos requieren la operación rápida. Este último es conveniente para todas las muestras, mientras que el anterior es solamente conveniente para los tejidos con el contenido bajo de células y de enzimas endógenas y más fácil de homogeneizar. Específicamente, el tejido vegetal, hígado, timo, páncreas, bazo, cerebro, grasa, tejido del músculo, etc. se congelan mejor con nitrógeno líquido antes del procedimiento.

Fragmentación y homogeneización de muestras

Los factores que afectan a la fragmentación de la muestra de la degradación y de la producción están para la homogeneización completa, que está para el lanzamiento completo y completo del ARN. Las células pueden ser homogeneizadas directamente sin la fractura. Los tejidos pueden ser homogeneizados sólo después de la fractura. La levadura y las bacterias necesitan estar rotas con las enzimas correspondientes antes de que puedan ser homogeneizadas. Los tejidos con un contenido endógeno más bajo de la enzima y una homogeneización más fácil se pueden machacar y homogeneizar al mismo tiempo en el lysate por un homogeneizador; el tejido vegetal, hígado, timo, páncreas, bazo, cerebro, grasa, tejido del músculo y otras muestras, son tampoco altos en enzimas endógenas o no se homogeneizan fácilmente, así que la interrupción y la homogeneización del tejido se deben realizar por separado. El método más confiable y más productivo de fragmentación está moliendo con nitrógeno líquido, y el método más de confianza de la homogeneización es el uso de un homogeneizador eléctrico. Una nota especial sobre moler con nitrógeno líquido: la muestra no se debe deshelar durante el proceso que muele entero, pues las enzimas endógenas son más probables funcionar cuando están congeladas.

Opción del lysate

Afectando a la conveniencia de la operación y a los factores de impurezas endógenas residuales las soluciones de uso general de la lisis pueden casi inhibir la actividad de la ARNasa. Por lo tanto, el punto clave de elegir una solución de la lisis es considerar conjuntamente con el método de la purificación. Hay una excepción: las muestras con el alto contenido endógeno de la enzima se recomiendan para utilizar un lysate que contiene el fenol para aumentar la capacidad de desactivar las enzimas endógenas.

Opción del método de la purificación

Los factores que afectan a impurezas endógenas residuales, velocidad de la extracción para las muestras limpias tales como células, los resultados satisfactorios se pueden obtener con casi cualquier método de la purificación a mano. Pero para muchas otras muestras, especialmente ésas con niveles de impurezas tales como plantas, hígado, bacterias, etc., elegir un método conveniente de la purificación es crucial. El método centrífugo de la purificación de la columna tiene una velocidad rápida de la extracción y puede quitar con eficacia las impurezas que afectan a la reacción enzimática subsiguiente del ARN, pero es costosa (Foregene puede ofrecer equipos rentables, más detalles hace clic aquí); usar métodos económicos y clásicos de la purificación, tales como precipitación del ClLi, puede también obtener resultados satisfactorios, pero el tiempo de la operación es largo.

“Tres disciplinas y ocho atenciones” para la extracción del ARN

Disciplina 1: Poner fin a la contaminación de enzimas exógenas.

Nota 1: Estrictamente máscaras y guantes del desgaste.

Nota 2: Los tubos de centrífuga, las cabezas de la extremidad, las barras de la pipeta, los tanques de la electroforesis, y los bancos experimentales implicados en el experimento deben ser dispuestos a fondo.

Nota 3: Los reactivo/las soluciones implicadas en el experimento, especialmente agua, deben ser ARNasa-libres.

Disciplina 2: Bloquee la actividad de enzimas endógenas

Nota 4: Elija un método apropiado de la homogeneización.

Nota 5: Elija un lysate apropiado.

Nota 6: Controle la cantidad que comienza de la muestra.

Disciplina 3: Aclare su propósito de la extracción

Nota 7: Con cualquier sistema del lysate acercándose a la cantidad que comienza máxima de muestra, el índice de éxito de la extracción cae agudamente.

Nota 8: El único criterio económico para la extracción acertada del ARN es un éxito en experimentos subsiguientes, no producción.

10 fuentes superiores de contaminación de la ARNasa

1. Los fingeres son la primera fuente de enzimas exógenas, así que los guantes se deben llevar y substituir con frecuencia. Además, las máscaras deben también ser llevadas, porque la respiración es también una fuente importante de enzimas. Una ventaja adicional de llevar una máscara del guante es proteger al experimentador.

2. Las extremidades de la pipeta, tubos de centrífuga, miden con una pipeta – la ARNasa no se puede desactivar por la esterilización solamente, así que las extremidades de la pipeta y los tubos de centrífuga se deben tratar con DEPC, incluso si se marcan como DEPC trató. Es el mejor utilizar una pipeta especial, la limpia con una bola de algodón del alcohol del 75% antes de usar, especialmente la barra; además, estar seguro de no utilizar un removedor principal.

3. El agua/el almacenador intermediario debe estar libres de la contaminación de la ARNasa.

4. Por lo menos la tabla de la prueba se debe limpiar limpia con las bolas de algodón del alcohol del 75%.

• La ARNasa endógena que todos los tejidos contienen las enzimas endógenas, congelación tan rápida de tejidos con nitrógeno líquido es la mejor manera de reducir la degradación. El almacenamiento del nitrógeno líquido/el método de pulido es de hecho incómodos, pero es la única forma para los tejidos con niveles de enzimas endógenas.

6. El ARN muestrea productos de la extracción del ARN puede contener rastros de contaminación de la ARNasa.

7. La extracción del plásmido de la extracción del plásmido utiliza a menudo la ARNasa para degradar el ARN, y la ARNasa residual se debe digerir con la proteinasa K y extraer por el PCI.

8. El almacenamiento incluso si se almacena en la baja temperatura, cantidades del ARN de rastro de ARNasa causará la degradación del ARN. La mejor solución para la preservación a largo plazo del ARN es una suspensión de la sal/del alcohol, porque el alcohol inhibe toda la actividad enzimática en las bajas temperaturas.

9. Cuando los cationes (Ca, magnesio) contienen estos iones, la calefacción en 80C por 5 minutos hará el ARN ser hendida, así que si el ARN necesita ser calentado, la solución de la preservación necesita contener a un agente quelante (citrato de sodio 1mM, pH 6,4).

10. Las enzimas usadas en experimentos subsiguientes se pueden contaminar por la ARNasa.

10 extremidades para la extracción del ARN

1: Rápidamente prevenir actividad de la ARNasa. Las muestras se congelan rápidamente después de la colección, y la ARNasa es desactivada por la operación rápida durante lisis.

2: Elija un método apropiado de la extracción para el tejido con el alto contenido del ribozyme, y el tejido adiposo es el mejor utilizar el método que contiene el fenol.

3: La calidad de la predicción requiere septentrional, la construcción de la biblioteca del cDNA requiere alta integridad, y RT-PCR y el RPA (análisis de la protección de la ribonucleasa) no requieren alta integridad. RT-PCR requiere la pureza elevada (residuos del inhibidor enzimático).

4: La homogeneización completa es la llave a mejorar la producción y a reducir la degradación.

5: Compruebe la integridad de la detección de la electroforesis del ARN, 28S: 18S = 2: 1 es una muestra completa, 1: 1 es también aceptable para la mayoría de los experimentos.

6: Retiro de la DNA para RT-PCR, análisis del arsenal es el mejor utilizar la ADNasa I para quitar la DNA.

7: Reduzca la contaminación de enzimas exógenas - las enzimas no se pueden importar del exterior.

8: Al concentrar el ácido nucléico de la bajo-concentración, un reactivo de la co-precipitación debe ser añadido. Pero para prevenir el co-precipitado que contiene las enzimas y la contaminación de la DNA.

9: Disuelva a fondo el ARN en caso de necesidad, calor en 65C por 5 minutos.

método conveniente del almacenamiento

Puede ser almacenado en – 20C por poco tiempo, y en – 80C durante mucho tiempo. El primer paso en la mejora de producciones del ARN es realizar que el contenido del ARN de diversas muestras varía grandemente. Alta abundancia (2-4ug/mg) por ejemplo el hígado, páncreas, corazón, abundancia media (0.05-2ug/mg) por ejemplo el cerebro, embrión, riñón, pulmón, timo, ovario, abundancia baja (<0>

1: Lyse las células para lanzar el RN – si el ARN no se libera, la producción será reducida. Los trabajos eléctricos de la homogeneización mejores que otros métodos de la homogeneización, pero pueden también necesitar ser combinado con otros métodos, tales como nitrógeno líquido que tritura, digestión enzimática (lisozima/Lyticase)

2: Optimización del método de la extracción. Los problemas más grandes con métodos fenol-basados son estratificación incompleta y pérdida parcial del ARN (el sobrenadante no se puede quitar totalmente). La estratificación incompleta es debido al alto contenido proteínico del ácido nucléico y, que puede ser solucionado aumentando la cantidad de lysate usada o reduciendo la cantidad de muestra. Un paso de la extracción de cloroformo fue añadido al tejido adiposo. La pérdida del ARN puede ser reducida detrás-bombeando o quitando la capa orgánica seguida por la centrifugación. El problema más grande con la columna centrifugación-basó métodos es exceso de muestra.

Extremidades clásicas de la extracción

1. Purificación del fenol: Añada un volumen igual de fenol/de cloroformo y de mezcla del 1:1 vigoroso por 1-2 minutos. Centrifugadora en la velocidad por 2 minutos. Quite cuidadosamente el sobrenadante (80-90%). Nunca consiga a la capa media. Un volumen igual de la solución de la reacción se puede añadir al fenol/al cloroformo y el sobrenadante quitó. Los dos supernatants se pueden mezclar juntos para que la precipitación ácida nucléica mejore la producción. No sea demasiado apacible al mezclarse, y no intente quitar todo el sobrenadante.

2. Lavado con el etanol 70-80%: Durante el lavado, el ácido nucléico se debe suspender para asegurarse de que la sal residual está quitada. Al mismo tiempo, inmediatamente después de la colada del etanol, la centrifugadora en la velocidad por algunos segundos, y entonces quita el etanol residual con una pipeta. Disuelva después de colocar en la temperatura ambiente por 5-10 minutos.

11. Extracción de organizaciones especiales

1. Tejido fibroso: La llave a la extracción del ARN del tejido fibroso tal como corazón/músculo esquelético es interrumpir totalmente el tejido. Estos tejidos tienen densidad de célula baja, así que la cantidad de ARN por el peso de unidad del tejido es baja, y es el mejor utilizar como mucha cantidad que comienza como sea posible. Esté seguro de moler el tejido a fondo bajo condiciones de congelación.

2. Tejidos con el contenido de alto valor proteico/de grasa: el cerebro/el contenido de grasa vegetal es altos. Después de la extracción del PCI, el sobrenadante contiene los grumos blancos. El sobrenadante se debe reextraer con cloroformo.

3. Tejidos con el alto contenido del ácido nucléico/del ribozyme: el bazo/el timo tiene alto contenido del ácido nucléico y del ribozyme. El tejido de pulido bajo condiciones de congelación seguidas por la homogeneización rápida puede desactivar con eficacia ribozymes. Sin embargo, si el lysate es demasiado viscoso (debido al alto grado de ácido nucléico), la extracción del PCI no podrá estratificar con eficacia; el adición de más lysate puede resolver este problema. Las extracciones múltiples del PCI pueden quitar una DNA más residual. Si las formas blancas de un precipitado inmediatamente después de añadir el alcohol, él indican la contaminación de la DNA. Reextracción con el PCI ácido después de que la disolución pueda quitar la contaminación de la DNA.

4. Tejido vegetal: El tejido vegetal es más complejo que el tejido animal. Generalmente, las plantas se muelen bajo condiciones del nitrógeno líquido, degradación del ARN por las enzimas endógenas son tan infrecuentes. Si el problema de la degradación no se resuelve, es causado casi ciertamente por las impurezas contenidas en la muestra. Las impurezas contuvieron en muchas plantas llevarán a los residuos, y la razón de residuos está a menudo porque estas impurezas tienen algunas semejanzas con ARN: usted se precipita y yo para precipitarse, y usted fija por adsorción y yo para fijar por adsorción. Estas características determinan que son inhibidores enzimáticos muy fuertes.

Actualmente, los reactivo comerciales de la extracción del ARN se pueden adaptar a casi todos los tejidos animales con pequeños ajustes, pero hay pocos reactivo comerciales de la extracción del ARN que pueden ser convenientes para la mayoría de los tejidos vegetales. Afortunadamente, Foregene puede proporcionar equipos especiales de la extracción del ARN de la planta, nosotros tenemos equipo total del aislamiento del ARN de la planta, más total del equipo del aislamiento del ARN de la planta. Este último se diseña especialmente para las plantas con el alto contenido del polisacárido y del polifenol. Para la extracción del ARN, la reacción de usuarios del laboratorio es particularmente buena.

12. El efecto de la muestra que congela y que deshiela la muestra congelada puede ser más grande, y necesita ser cortado antes de ser utilizado para la extracción del ARN. Las muestras tienden a derretir (posiblemente parcialmente) durante el corte. Las muestras congeladas pueden necesitar ser pesado antes de la extracción del ARN, y el deshielo ocurrirá definitivamente durante este proceso. A veces, el deshielo de la muestra también ocurre durante el proceso que muele del nitrógeno líquido; o la muestra congelada se añade directamente al lysate sin el nitrógeno líquido que muele, y el deshielo ocurrirá definitivamente antes de la homogeneización completa. Los experimentos han mostrado que el tejido congelado es una degradación más propensa del ARN durante el deshielo que tejido fresco. La razón probable: El proceso hielo-deshielo interrumpe las estructuras dentro de la célula, haciéndola más fácil para que las enzimas endógenas entren en el contacto directo con el ARN.

13. El juicio de la calidad del ARN generalmente, electroforesis se utiliza para juzgar la integridad del ARN, y A260/A280 se utiliza para juzgar la pureza del ARN. En teoría, el ARN intacto tiene un ratio de 28S: 18S = el 2.7:1, y la mayoría de los datos acentúan el ratio de 28S: 18S = 2: 1. El hecho es que casi ninguno del ARN extraído de muestras con excepción de las células está en un ratio del 2:1 (esto fue obtenida usando el Agilent Bioanalyzer).

Los resultados de la electroforesis del ARN son afectados por muchos factores, incluyendo la estructura secundaria, condiciones de la electroforesis, carga de la muestra, el grado de saturación por el EB, el etc. Utilice la electroforesis nativa para detectar el ARN y para utilizar al marcador de la DNA como control. Si los 28S en 2kb y el 18S en 0.9kb son claros, y 28S: 18S > 1, la integridad puede cumplir los requisitos de la mayoría de los experimentos subsiguientes.

A260/A280 es un indicador que ha causado mucha confusión. En primer lugar, es necesario aclarar el significado original de este indicador para los ácidos nucléicos: ARN puro, su A260/280 = cerca de 2,0. El ARN puro es los because y A260/A280 = 2 es el ‘efecto’. Ahora todo el mundo está utilizando A260/A280 como because, pensando eso “si A260/A280 = 2, después el ARN es puro”, que lleva naturalmente a la confusión.

Si usted está interesado, usted puede añadir un pequeño reactivo que sea de uso frecuente en la extracción, tal como fenol, isotiocianato de la guanidina, CLAVIJA, etc., a su muestra del ARN, y después mida el ratio A260/A280. La realidad es que muchos de los reactivo usados para la extracción del ARN, así como muchas impurezas en la muestra, absorben alrededor de A260 y de A280, afectando a A260/A280.

El acercamiento más instructivo es actualmente explorar muestras del ARN en la gama de 200-300 nanómetro. La curva del ARN puro tiene las siguientes características: la curva es lisa, A230 y A260 son dos puntos de la inflexión, A300 están cercanos a 0, a A260/A280 = alrededor 2,0, y a A260/A230 = alrededor 2,0. Si los datos de la exploración no están disponibles, el ratio A260/A230 debe también ser resuelto, pues este ratio es más sensible al remanente de todas las impurezas que afecten a la reacción enzimática. Tenga en cuenta la gama linear del dispositivo (0.1-0.5 para A260).

Hay dos otros fenómenos útiles: el ratio será cerca de 0,3 más bajo cuando A260/A280 se mide en agua; mientras que el ratio midió en EDTA de 10 milímetros es cerca de 0,2 más alto que lo medida en EDTA de 1 milímetro.