Preguntas frecuentes sobre el kit de aislamiento de ARN total animal/celular

El siguiente análisis de los problemas que puede encontrar en la extracción de ARN de células/tejidos animales lo ayudará con sus experimentos.Además, para otros problemas técnicos o experimentales además de las instrucciones de funcionamiento y el análisis de problemas, contamos con soporte técnico dedicado para ayudarlo.Si tiene alguna necesidad, comuníquese con nosotros al: 028-83360257 o E-mali: Tech@foregene.com.

El ARN no se extrae o los rendimientos de ARN son bajos

A menudo hay una variedad de factores que afectan la eficiencia de la recuperación, como: el contenido de ARN de la muestra de tejido, el método de operación, el volumen de elución, etc.

1. Se realizó un baño de hielo o centrifugación criogénica (4 °C) durante la operación.

Recomendación: Operar a temperatura ambiente (15-25°C) durante todo el proceso, no bañar en hielo y centrifugar a bajas temperaturas.

2. Conservación inadecuada de la muestra o tiempo excesivo de almacenamiento de la muestra.

Recomendación: almacene las muestras a -80 °C o congélelas en nitrógeno líquido y evite el uso repetido de congelación y descongelación;trate de usar tejido fresco o células cultivadas para la extracción de ARN.

3. Lisis de muestra insuficiente.

Recomendación: Al homogeneizar tejido, asegúrese de que el tejido esté lo suficientemente homogeneizado y que las células del tejido estén suficientemente divididas para explicar la liberación de ARN.

4. El eluyente no se agrega correctamente.

Recomendación: confirme que se agrega gota a gota ddH2O sin ARNasa en el centro de la membrana de la columna de purificación.

5. No se agregó el volumen correcto de etanol absoluto al tampón RL2 o al tampón RW2.

Recomendación: Siga las instrucciones, agregue el volumen correcto de etanol absoluto a Buffer RL2 y Buffer RW2 y mezcle bien antes de usar el kit.

6. La dosificación de la muestra de tejido no es adecuada.

Recomendación: use 10-20 mg de tejido o (1-5) × 106 células por 500 μl de tampón RL1, ya que el uso excesivo de tejido puede resultar en una reducción de la extracción de ARN.

7. Volumen de elución inadecuado o elución incompleta.

Recomendación: El volumen de elución de la columna de purificación es de 50-200 μl;si el efecto de elución no es satisfactorio, se recomienda extender el tiempo de colocación a temperatura ambiente después de agregar ddH2O sin ARNasa precalentada, por ejemplo, durante 5 a 10 minutos.

8. La columna de purificación tiene residuos de etanol después del lavado con el tampón RW2.

Recomendación: Si hay residuos de etanol después del lavado del Buffer RW2, centrifugar el tubo vacío durante 1 min, el tiempo de la operación de centrifugado del tubo vacío se puede aumentar a 2 min, o la columna de purificación se puede colocar a temperatura ambiente durante 5 min para eliminar adecuadamente el residuo etanol.

El ARN purificado se degrada

La calidad del ARN purificado está relacionada con factores como la conservación de la muestra, la contaminación por RNasa, la manipulación, etc.

1. Las muestras de tejido no se conservan a tiempo.

Recomendación: si las muestras de tejido o las células no se utilizan de manera oportuna después de la recolección, criopreservar inmediatamente a -80 °C o nitrógeno líquido.Para extraer el ARN, utilice una muestra de tejido o de células recién extraída siempre que sea posible.

2. Congelación-descongelación repetida de muestras de tejido.

Recomendación: cuando almacene muestras de tejido, es mejor cortarlas en pedazos pequeños para su conservación y quitar una de las piezas cuando las use para evitar la congelación-descongelación repetida de la muestra y la degradación del ARN.

3. Se introduce RNasa o no se usan guantes desechables, mascarillas, etc. durante la operación.

Recomendación: los experimentos de extracción de ARN se realizan mejor en salas de manipulación de ARN separadas y la mesa se limpia antes del experimento.

Use guantes y máscaras desechables durante el experimento para minimizar la degradación del ARN causada por la introducción de RNasa.

4. Los reactivos se contaminan con RNasa durante el uso.

Recomendación: reemplazar con un nuevo kit de aislamiento de ARN total animal para experimentos relacionados.

5. Los tubos de centrífuga, las puntas, etc. que se utilizan en la manipulación del ARN están contaminados con ARNasa.

Recomendación: Confirme que los tubos de centrífuga, las puntas, las pipetas, etc. utilizados en la extracción de ARN estén libres de ARNasa.

El ARN obtenido purificado afecta a los experimentos posteriores

El ARN purificado por la columna de purificación, si los iones de sal, el contenido de proteína es demasiado grande afectará el experimento posterior, como: transcripción inversa, Northern Blot et al.

1. El ARN eluido tiene residuos de iones de sal.

Recomendación: Confirme que se haya agregado el volumen correcto de etanol al Buffer RW2 y realice 2 lavados de columna de purificación a la velocidad centrífuga indicada para la operación;si hay algún residuo de iones de sal, deje la columna de purificación en Buffer RW2 durante 5 min a temperatura ambiente y realice la centrifugación para maximizar la eliminación de la contaminación por sal.

2. Residuo de etanol en ARN eluido.

Recomendación: Confirmar que después del lavado con tampón RW2, realice la operación de centrifugado de tubos vacíos a la velocidad de centrifugado indicada para la operación, aumente el tiempo de la operación de centrifugado de tubos vacíos a 2 min si todavía hay residuos de etanol, o déjelo a temperatura ambiente durante 5 minutos. min después de la centrifugación en tubo vacío para maximizar la eliminación de residuos de etanol.